طرق التعقيم في مختبرات زراعة الأنسجة النباتية

تعتبر عمليات التعقيم من الركائز الأساسية في مختبرات زراعة الأنسجة النباتية، حيث تلعب دورًا محوريًا في نجاح التجارب وضمان الحصول على نباتات صحية خالية من الملوثات. تعتمد زراعة الأنسجة النباتية على استنبات الأنسجة أو الخلايا في وسط مغذي معقم، مما يجعل التعقيم خطوة لا غنى عنها لتجنب نمو البكتيريا والفطريات التي قد تؤدي إلى فشل العملية بأكملها. يتناول هذا المقال بشكل موسع ووافي طرق التعقيم المختلفة المستخدمة في مختبرات زراعة الأنسجة النباتية، مع توضيح أهميتها، الأدوات المستخدمة، وطرق تطبيقها، كما يشرح كيفية اختيار طريقة التعقيم المناسبة لكل مادة أو مرحلة من مراحل الزراعة.

أهمية التعقيم في زراعة الأنسجة النباتية

إن البيئة المعقمة ضرورية جداً في مختبرات زراعة الأنسجة النباتية لأن الأوساط المغذية التي تُستخدم في إنبات الأنسجة توفر بيئة غنية بالمواد الغذائية التي تساعد ليس فقط على نمو الأنسجة النباتية وإنما أيضاً على نمو الميكروبات الضارة. وبالتالي، فإن أي تلوث صغير يمكن أن يؤدي إلى فساد الوسط وفشل زراعة الأنسجة.

تتمثل أهمية التعقيم في:

• إزالة كافة الكائنات الحية الدقيقة، مثل البكتيريا والفطريات والفيروسات.

• تقليل نسبة الفاقد وتحسين كفاءة إنتاج النباتات.

• ضمان نقاء النباتات المنتجة ورفع جودتها.

• تقليل التكاليف الناجمة عن خسارة الأوساط المغذية والمواد الخام.

أنواع الملوثات التي يتم القضاء عليها

الملوثات التي تهدف عمليات التعقيم إلى القضاء عليها تشمل:

• البكتيريا: وهي من أكثر الملوثات شيوعًا وخطورة في المختبرات.

• الفطريات: خاصة الفطريات الخيطية التي قد تتسبب في عفن الأنسجة.

• الفيروسات: على الرغم من صعوبة القضاء عليها كليًا، إلا أن التعقيم يحد من انتقالها.

• الجراثيم والبذور الدقيقة: التي يمكن أن تتواجد على الأدوات أو الأنسجة النباتية نفسها.

طرق التعقيم في مختبرات زراعة الأنسجة النباتية

تعتمد طرق التعقيم في مختبرات زراعة الأنسجة على نوع المادة التي يتم تعقيمها، سواء كانت أوساطًا غذائية، أدوات، أو أنسجة نباتية. يمكن تقسيم طرق التعقيم إلى طرق فيزيائية وكيميائية، مع وجود بعض الطرق البيولوجية التي تستخدم في بعض الحالات الخاصة.

1. التعقيم بالطرق الفيزيائية

أ. التعقيم بالبخار (Autoclaving)

يعد التعقيم بالبخار باستخدام جهاز الأوتوكلاف من أكثر طرق التعقيم فعالية وانتشارًا في مختبرات زراعة الأنسجة النباتية. يعتمد هذا الأسلوب على تعريض المواد المراد تعقيمها لبخار الماء المضغوط عند درجة حرارة 121 درجة مئوية تحت ضغط 15 رطل/بوصة مربعة لمدة 15-20 دقيقة.

• المواد التي يمكن تعقيمها: الأوساط الغذائية، الأدوات المعدنية والزجاجية، الأقمشة المعملية.

• مميزات الطريقة: قتل جميع أنواع الملوثات، بما في ذلك البكتيريا، الفطريات، وأبواغ الجراثيم.

• القيود: لا يمكن استخدام الأوتوكلاف على المواد التي تتأثر بالحرارة مثل بعض المواد البلاستيكية أو المحاليل التي تحتوي على مكونات حرارية حساسة.

ب. التعقيم بالحرارة الجافة (Dry Heat Sterilization)

يتم في هذه الطريقة تعريض الأدوات الزجاجية والمعدنية لدرجة حرارة عالية تصل إلى 160-180 درجة مئوية لفترة تتراوح بين 1-2 ساعة.

• المواد التي تعقم بهذه الطريقة: الأدوات الزجاجية مثل الملاعق، الأنابيب، والأنابيب المختبرية.

• المميزات: فعالية عالية في القضاء على البكتيريا والجراثيم.

• العيوب: استهلاك وقت طويل، وارتفاع درجة الحرارة قد يؤدي إلى تلف بعض الأدوات.

ج. التعقيم بالإشعاع

يستخدم هذا الأسلوب في تعقيم بعض المواد البلاستيكية الحساسة للحرارة مثل الأنابيب والحاويات، ويعتمد على تعريض المواد للأشعة فوق البنفسجية أو أشعة جاما.

• الاستخدامات: تعقيم البلاستيك والمواد الحساسة.

• القيود: يحتاج إلى معدات خاصة، وقد يؤدي التعرض الطويل إلى تغير في خواص المواد.

د. التعقيم بالفلترة (Filtration)

يستخدم هذا الأسلوب في تعقيم المحاليل التي لا يمكن تعقيمها بالحرارة مثل بعض المحاليل الغذائية أو الإنزيمات. يتم تمرير المحلول عبر مرشحات ذات مسام صغيرة (عادة 0.22 ميكرون) التي تحجز البكتيريا والكائنات الدقيقة.

• المواد المعقمة: المحاليل الحساسة للحرارة.

• المميزات: يحافظ على خصائص المحاليل.

• العيوب: لا يزيل الفيروسات أو بعض الجزيئات الصغيرة.

2. التعقيم بالطرق الكيميائية

تعتمد هذه الطرق على استخدام مواد كيميائية معقمة تقوم بالقضاء على الميكروبات. تستخدم هذه الطريقة بشكل خاص في تعقيم الأنسجة النباتية نفسها أو الأسطح.

أ. الكحول الإيثيلي والايزوبروبيلي

الكحول بنسبة 70% هو مطهر فعال يُستخدم لتنظيف الأدوات والأسطح وكذلك تعقيم الأنسجة النباتية الخارجية قبل إدخالها إلى الوسط الغذائي.

• طريقة الاستخدام: تُغطى الأدوات أو الأنسجة بالكحول لمدة قصيرة (30 ثانية إلى 2 دقيقة).

• مميزات: سريع المفعول، متاح ورخيص.

• محددات: لا يستخدم لتعقيم الأوساط الغذائية أو المواد الحساسة للحرارة.

ب. مركبات الهيبوكلوريت (مبيض الكلور)

مستخدم لتعقيم الأسطح والأدوات، وهو فعال جدًا في قتل البكتيريا والفطريات.

• طريقة الاستخدام: يتم تخفيفه وفقًا لتركيز معين (غالبًا 0.5%-1% من محلول الهيبوكلوريت).

• العيوب: مادة كيميائية قوية قد تسبب تآكل الأدوات وتغير خواصها.

ج. مركبات الفورمالديهايد

تُستخدم أحيانًا في تعقيم غرف العمل أو الأدوات المعملية بحالة بخار الفورمالديهايد، لكن استخدامها محدود بسبب سميتها وتأثيرها الصحي الضار.

د. بيروكسيد الهيدروجين

مادة معقمة تُستخدم لتطهير الأسطح وتعقيم الأدوات، وخصوصًا في الحالة المخففة.

• مميزات: فعالة ضد مجموعة واسعة من الميكروبات، غير سامة نسبيًا.

• الاستخدام: يُرش أو يُمسح على الأسطح.

3. تعقيم الأنسجة النباتية قبل الزراعة

تعقيم الأنسجة النباتية نفسها هو من أكثر العمليات حساسية في زراعة الأنسجة النباتية. يتطلب تعقيم الأنسجة إزالة الملوثات من سطح النبات مع الحفاظ على حيوية الأنسجة الداخلية.

خطوات التعقيم الأساسية للأنسجة النباتية:

1. غسل الأنسجة: تُغسل الأنسجة بالماء الجاري لإزالة الأتربة والشوائب.

2. النقع في مطهر: تُنقع الأنسجة في محلول مطهر، غالبًا يحتوي على الكلور أو الكحول، لفترة قصيرة.

3. شطف الأنسجة: تُشطف الأنسجة بالماء المعقم لإزالة بقايا المطهرات.

4. تقطيع الأنسجة: تُقطع الأنسجة المعقمة إلى أجزاء صغيرة بحذر داخل بيئة معقمة.

أمثلة على المواد المستخدمة في تعقيم الأنسجة:

• محلول الهيبوكلوريت الصوديوم (1-2%): يستخدم لفترات تتراوح بين 5 إلى 15 دقيقة.

• الكحول 70%: يستخدم لفترات قصيرة (دقائق معدودة).

• مركبات أخرى مثل الزئبق (Thimerosal): تستخدم أحيانًا ولكن مع الحذر بسبب السمية.

4. تعقيم أدوات المختبر

الأدوات التي تُستخدم في زراعة الأنسجة يجب أن تكون معقمة تمامًا لتفادي أي تلوث.

• الملاعق، المشارط، المقصات: تعقم عادة بالأوتوكلاف أو حرارة جافة.

• أنابيب الزجاج والبلاستيك: تعقم بالأوتوكلاف أو الفلترة حسب المادة.

• البيئات العمل (أغطية الأمان الحيوي): يتم تعقيم الأسطح قبل وبعد العمل باستخدام الكحول أو مركبات بيروكسيد الهيدروجين.

• القفازات والمعاطف: يجب أن تكون نظيفة ومعقمة أو جديدة لضمان عدم نقل الملوثات.

5. تعقيم الأوساط الغذائية المستخدمة

الأوساط الغذائية هي البيئة التي تنمو فيها الأنسجة النباتية، وتتكون من عناصر غذائية معقدة مثل السكريات، الأملاح، الفيتامينات، والهرمونات النباتية.

• تعقيم الأوساط الغذائية يتم غالبًا بالأوتوكلاف وذلك لضمان خلوها من أي ملوثات.

• بعض المواد الحساسة للحرارة مثل بعض الفيتامينات أو الهرمونات تُضاف بعد تعقيم الوسط باستخدام الفلترة.

• يتم تحضير الوسط داخل ظروف معقمة لتجنب التلوث.

6. تعقيم البيئة المعملية

• تعقيم الغرف والمعدات الكبيرة يتم باستخدام بخار الفورمالديهايد أو باستخدام أجهزة توليد البخار تحت ضغط عالي.

• استخدام مصابيح الأشعة فوق البنفسجية في الأجنحة المخصصة لزراعة الأنسجة لقتل الجراثيم المحمولة جواً.

• الالتزام بالنظافة الشخصية الصارمة من قبل الفنيين والباحثين لمنع التلوث.

جدول يوضح مقارنة بين طرق التعقيم المختلفة

الخلاصة

تُعد عمليات التعقيم في مختبرات زراعة الأنسجة النباتية من العمليات الحيوية التي تحدد نجاح إنتاج نباتات نقية وصحية. يتطلب الأمر اختيار الطريقة المناسبة لكل مادة أو مرحلة لضمان القضاء على الملوثات دون الإضرار بالمواد أو الأنسجة. تقنيات التعقيم المتنوعة مثل التعقيم بالبخار، الحرارة الجافة، الفلترة، والتعقيم الكيميائي تضمن بيئة معملية مثالية تحفز النمو النباتي السليم. يجمع المختصون بين عدة طرق أحيانًا للحصول على أفضل النتائج، مع مراعاة حساسية المواد المستخدمة.

المصادر والمراجع

1. George, E.F., Hall, M.A., De Klerk, G.-J. (2008). Plant Propagation by Tissue Culture. Volume 1. The Background. Springer.

2. Thorpe, T.A. (2007). Plant Tissue Culture: Methods and Applications. Academic Press.